,

10 советов и рекомендаций по созданию многоцветных панелей

  1. Ознакомьтесь с вашим проточным цитометром
  2. Подготовьте образец правильно
  3. Удалить мертвые клетки
  4. Оптимизируйте свой протокол окрашивания
  5. Решите, следует ли включать элементы управления изотипом и когда
  6. Контроль внутриклеточного окрашивания, проницаемость и потенциальные проблемы
  7. Сборка эффективных многоцветных панелей
  8. Многоцветная панель управления
  9. Знай свою биологию
  10. Обращайтесь с вашими флуорофорами осторожно
  11. Полезные ресурсы проточной цитометрии

Мы знаем, насколько сложным может быть создание многоцветных панелей проточной цитометрии. Вот почему мы разработали набор советов, которые помогут вам. Темы включают в себя:

Десять советов и рекомендаций по созданию многоцветных панелей проточной цитометрии

Скачать PDF

Создайте многоцветные панели для проточной цитометрии всего за несколько простых шагов

  1. Ознакомьтесь с вашим проточным цитометром
  2. Подготовьте образец правильно
  3. Удалить мертвые клетки
  4. Оптимизируйте свой протокол окрашивания
  5. Решите, следует ли включать элементы управления изотипом и когда
  6. Контроль внутриклеточного окрашивания, проницаемость и потенциальные проблемы
  7. Сборка эффективных многоцветных панелей
  8. Многоцветная панель управления
  9. Знай свою биологию
  10. Обращайтесь с вашими флуорофорами осторожно

Ознакомьтесь с вашим проточным цитометром

Важно понимать возможности вашего проточного цитометра. Большинство новых цитометров имеют три или более лазеров, выбранных из ультрафиолетового (355 нм), фиолетового (405 нм), синего (488 нм), желтого (561 нм) и красного (640 нм). Помимо лазеров, существуют специальные фильтры и детекторы, которые определяют конфигурацию. Эти компоненты определяют, сколько цветов может быть обнаружено одновременно (для новых цитометров это может быть> 17). Регулярная калибровка с использованием флуоресцентных шариков и очистки позволит вам получить максимальную отдачу от вашего проточного цитометра.

Подготовьте образец правильно

Плохо подготовленные или нездоровые клетки приведут к неоптимальным результатам из-за неточного стробирования и повышенной фоновой автофлуоресценции. Также важно аккуратно обрабатывать клетки и избегать встряхивания при изготовлении клеточных суспензий. Во время окрашивания клетки предпочтительно держать на льду (если позволяет эксперимент). Чтобы уменьшить образование агрегатов, которые могут блокировать проточную ячейку, следует избегать высокой плотности клеток. Добавление DNAseI или EDTA, а также фильтрация также могут помочь уменьшить агрегаты.

Удалить мертвые клетки

Мертвые клетки могут приводить к ложноположительным результатам из-за аутофлуоресценции и увеличения неспецифического связывания антител. Они не всегда могут быть удалены с помощью стробирования FSC и SSC, поэтому лучше использовать живой / мертвый маркер исключения. Пропидий йодид ( ReadiDrop ™ пропидий йодид ) или 7AAD ( ReadiDrop ™ 7AAD ) обычно используются для идентификации мертвых клеток, но их нельзя использовать с фиксированными клетками. К счастью, существует ряд реагентов для живых / мертвых клеток, таких как Vivafix ™ , который можно использовать с живыми или мертвыми клетками.

Оптимизируйте свой протокол окрашивания

Неспецифическое связывание антител из-за заряда или белок-белковых взаимодействий может привести к ложным срабатываниям. Это может быть уменьшено путем включения BSA или неконъюгированного антитела в ваш окрашивающий буфер, чтобы блокировать эти взаимодействия. Кроме того, многие клетки (например, В-клетки, NK-клетки и макрофаги) имеют на своей клеточной поверхности рецепторы Fcγ, которые могут связываться с областью Fc вашего антитела, что приводит к неспецифическому окрашиванию. Их можно блокировать добавлением реагентов, блокирующих FcR, или использованием фрагментов F (ab) 2, которые не содержат часть Fcγ. Высокие концентрации антител также могут увеличивать неспецифическое связывание; поэтому все антитела должны быть правильно титрованы, чтобы максимизировать отношение сигнал / шум. Использование соответствующих концентраций антител имеет решающее значение для многоцветного потока.

Решите, следует ли включать элементы управления изотипом и когда

Возможно, вы не захотите использовать элементы управления изотипом, но если вы это сделаете, убедитесь, что вы включили другие соответствующие элементы управления, о которых мы расскажем позже. Контроль изотипа был разработан для окрашивания поверхности, чтобы определить, что является специфическим. Правильный контроль изотипа - это антитело, сгенерированное против нерелевантного антигена (например, KLH) того же подкласса антител, с тем же конъюгированным флуорофором, которое получено от того же поставщика, что и ваше тестируемое антитело, и использовано в той же концентрации. Их цель состоит в том, чтобы гарантировать, что наблюдаемое окрашивание связано со специфическим связыванием антител, а не с артефактом, чтобы исключить неспецифическое связывание с рецепторами Fcγ и исключить неспецифическое связывание антитела или флуорофора (такого как РЕ) с клеточными компонентами.

Контроль внутриклеточного окрашивания, проницаемость и потенциальные проблемы

Внутриклеточное окрашивание может быть более проблематичным, чем окрашивание клеточной поверхности, и в этом случае контроль изотипа может не подходить. Хорошей практикой является наличие нескольких контролей, чтобы можно было точно определить вашу положительную популяцию. Они могут включать неокрашенный образец, отрицательный образец, окрашенный антителом, которое не экспрессирует интересующий антиген, или известный положительный образец. Существует несколько протоколов пермеабилизации, в которых используются коммерческие реагенты (например, Leucoperm ™ ) отдельно или в сочетании с метанолом или с мягкими моющими средствами, такими как сапонин. Различные методы могут улучшить окрашивание, но некоторые конъюгаты следует избегать (например, PE при использовании метанола). Наконец, по возможности избегайте использования биотина и FITC во внутриклеточных панелях. Эндогенный биотин должен блокироваться неконъюгированным стрептавидином, и FITC может неспецифически связываться посредством электростатических взаимодействий.

Сборка эффективных многоцветных панелей

Когда спектры излучения двух флуорофоров перекрываются, может наблюдаться перетекание одного флуорофора в канал обнаружения другого (например, FITC и PE). Это может затруднить идентификацию отдельных групп населения без использования коррекции перелива через метод, называемый компенсацией. Там, где это возможно, перелив можно свести к минимуму, выбрав флуорофоры, которые практически не перекрываются, однако это не всегда возможно при использовании нескольких флуорофоров. Средство просмотра спектра может помочь в получении наиболее подходящих профилей излучения. Использование флуорофоров с небольшим или нулевым перекрытием для маркеров подмножеств клеток (например, подмножеств Т-клеток) и близко перекрывающихся флуорофоров для взаимоисключающих маркеров (таких как CD3 и CD19) может предотвратить снижение чувствительности из-за распространения флуоресценции.

Многоцветная панель управления

Для многоцветных панелей одноцветные элементы управления компенсацией необходимы для расчета значений компенсации. Значения компенсации также можно определить с помощью гранул, связывающих антитела, помеченных на вашей предложенной многоцветной панели. Наконец, контроли флуоресценции минус один (FMO) могут определять распространение флуоресценции, граничные границы и помогают избежать снижения чувствительности.

Знай свою биологию

Флюорофоры с самым ярким индексом окраски (например, PE) лучше всего использовать для клеток с наименьшей экспрессией антигена или наименьшим поднабором, тогда как димерные флуорофоры больше подходят для более высокоэкспрессируемых антигенов. Однако при использовании нескольких цветов могут потребоваться компромиссы из-за наличия флуорофоров, антител и конфигурации проточного цитометра. Тандемные красители могут усложнить процесс из-за вторичной флуоресценции донорного флуорофора во многие другие каналы флуорофора. Таблицы индекса окрашивания доступны, чтобы помочь с многоцветным дизайном панели, чтобы минимизировать это.

Обращайтесь с вашими флуорофорами осторожно

При увеличении количества цветов на панели вам придется использовать тандемные красители, такие как PE-Alexa-Fluor 647 или APC-Cy7, которые увеличивают диапазон излучения от одного лазера. Однако они подвержены деградации под действием света и клеточной биологической активности, что приводит к расцеплению и флуоресцентному излучению на двух длинах волн, что приводит к ложным срабатываниям. Яркость тандемных красителей может быть уменьшена путем фиксации и проницаемости, поэтому в идеале эти шаги должны быть как можно более мягкими. Значения компенсации должны быть получены из образцов, обработанных идентичным образом, чтобы учесть это.

Полезные ресурсы проточной цитометрии

Рекомендации

Герценберг Л. и соавт. Nat Imm 2006, Maecker HT и Trotter J. цитометрия Часть А 2006

Похожие

Узнай свою группу крови
... ий медик взяла кровь в 1667 году. Группа крови не только влияет на склонность к определенным заболеваниям, но и указывает на то, что мы должны есть. Впервые французский медик взяла кровь в 1667 году. Донором был ягненок, у которого был сильно лихорадочный шестнадцатилетний мальчик. Лишь через 150 лет после этого успешного медицинского эксперимента они обменялись кровью между людьми. Были чудесные исцеления - например, женщины в послеродовом периоде с сильным кровотечением. Но многие
Можно ли подкислять организм через плохую диету?
Этот пост необычен. Тема «подкисления организма» оказалась настолько обширной, что я решил вместо обычного текста подготовить графику, которая собирает большинство вопросов, связанных с ней. Как это прочитать? Нажмите на эту ссылку - под ней вы найдете полноразмерную графику , Прокручивай, двигай и читай. Если у вас есть сомнения, правда ли это - в конце этого текста вы найдете
Цветные серые клетки: как работают наши глаза?
Экрю, пурпурный, горчица, лосось, фисташка, сельдерей ... Вы не знаете, что происходит? Возможно, в вашей Х-хромосоме есть генетический дефект, или, может быть, вы принадлежите к какому-то экзотическому племени. В богатом мире красок не сложно потеряться - особенно мужскому. Пчелы видят ультрафиолет, рептилии - инфракрасные, но нам нечего стыдиться. Структура глаза позволяет среднему человеку различать около миллиона цветов и оттенков. Редко, каких животных (кроме наших ближайших родственников
Вот таблица от доктора Комаровского о том, когда надо пить антибиотики. А когда - нет
Несмотря на свои преимущества, антибиотики имеют побочные эффекты. Поэтому нужно быть очень осторожным при их применении, особенно это касается лечения детей. Ведь организм ребенка не всегда может справиться с последствиями приема сильнодействующих лекарств, передает
Конверты ,, Открывай когда ... "- идея для необычного подарка
Что такое конверты "Открывать когда ..." и что на них писать? Вы узнаете все из этой записи! Конверты «Открой когда ...» - отличная идея для необычного подарка, а не только для праздников. Что они? Как следует из названия, это конверты со словами «Открыть, когда ...». Вместо эллипса мы входим в данные ситуации. Они также могут быть различными типами задач, вознаграждением за которые будет содержимое конверта. Если у вас есть голова, полная идей и ручного труда, вы легко можете приготовить
Как правильно украсить небольшую гостиную?
... и планировании ремонт В гостиной следует обратить внимание на несколько аспектов. Продуманные и правильно реализованные, они могут создать практичное и приятное пространство из маленькой комнаты. Стоит использовать разные хитрости, которые оптически увеличивают интерьер. В сегодняшней статье я уделю большое внимание выбору цветов стен, а также адекватному освещению. «Хорошо продуманные и правильно реализованные,
Общие Поморские Проблемы со здоровьем
Поморские Факты Померанский шпиц является самым маленьким членом семьи северных пород шпиц и является потомком ездовых собак из Исландии и Лапландии. На сегодняшний день Поморская собака является одной из самых популярных пород Той. Поморцы умны, очень легко обучаемы, активны и бдительны. Несмотря на их размер, Поморцы могут быть смелыми с другими крупными собаками, а также могут быть очень
Подходит для вегетарианцев / подходит для веганов - когда вы можете написать?
Производители продуктов питания соревнуются в идеях, чтобы убедить потребителей в том, что продукт лучше всего соответствует их потребностям и превосходит определенные конкурентоспособные продукты. Все чаще на этикетках продуктов питания отмечаются, среди прочего, информация о том, что они могут быть съедены вегетарианцами или веганами. Использование таких требований регулируется законом, поэтому вам необходимо знать, когда и как вы можете их использовать. Почему эти признаки?
Псевдо или вторичная ахалазия: могут ли различаться манометрические данные? Существуют ли конкретные критерии, позволяющие о...
Псевдо или вторичная ахалазия: могут ли различаться манометрические данные? Существуют ли конкретные критерии, позволяющие отличить ахалазию от основного злокачественного образования? RC Орландо (Новый Орлеан) Псевдоахалазия, по определению, представляет собой состояние, при котором у пациентов присутствуют признаки и симптомы, согласующиеся с первичной ахалазией, но которые вместо этого возникают вследствие инвазии дистального отдела пищевода или его нервного сплетения
Коллаген пить - Когда первые признаки старости провести свой сон с веками!
В последнее время коллагеновые препараты завоевывают рынок косметики, гарантируя очень хорошие результаты в улучшении состояния кожи, волос и ногтей, а также эффективно останавливают процесс старения эпидермиса. Коллаген является компонентом многих косметических средств - в конце концов, мы знаем об их составе. Он играет важную роль в нашем организме: не только в улучшении внешнего вида кожи, но также волос, суставов и ногтей. Коллаген - белок молодости Коллаген
Шрамы - когда использовать и каковы последствия?
... используется для повреждения пораженной кожи после травмы, ожогов или операции. Шрам был создан после повреждения кожи, к сожалению, он остается навсегда, но благодаря шраму от пятна он может быть гораздо менее заметен. Каковы типы рубцов, когда их использовать и каковы последствия?

Комментарии

Вопрос только в том, эффективны ли они и способны ли они справиться с растяжками?
Вопрос только в том, эффективны ли они и способны ли они справиться с растяжками? Я согласен, что они улучшают кровообращение. Это положительно влияет на оксигенацию тканей и улучшает тонус кожи. Однако, что касается растяжек, единственное, что они могут сделать, - это сделать их гибкими. Они не вызовут растяжек или их сужения. Почему? Потому что самодельные методы работают только на уровне эпидермиса. Степень клинической картины больше похожа на шрам и намного глубже. Конечно,
Значит ли это, что мы не должны выходить из дома или забывать о пикниках на лугу?
Значит ли это, что мы не должны выходить из дома или забывать о пикниках на лугу? Абсолютно нет - однако, стоит осознать, что существует реальная опасность, и есть простые методы, которым вы должны следовать, чтобы минимизировать их.
Существует ли такая вещь, как универсальная диета для пожилых людей?
Существует ли такая вещь, как универсальная диета для пожилых людей? Несомненно, есть определенные принципы питания, которым должны следовать пожилые люди, если только они не страдают от болезней, связанных с питанием. Стоит вспомнить декалог старшей диеты: 1. Питание х 5 - кушать около 5 раз в день. 2. Два литра воды - выпивайте около 2 литров жидкости в день (это чрезвычайно важно, потому что с возрастом жажда уменьшается, но в то же
Кто должен включать его в свою заботу?
Кто должен включать его в свою заботу? Ферментативный пилинг в отличие от механических скрабов, он не удаляет мертвые клетки кожи с частицами. Это косметическое средство больше похоже на крем, чем на эмульсию, содержащую абразив. Поэтому многие люди предполагают, что энзимный пилинг не для них. Между тем его преимуществами обладают не только владельцы сухой, чувствительной
Есть ли надежный способ неудобных булавок и как правильно наклеивать zapiętki Shine ?
Кто должен включать его в свою заботу? Ферментативный пилинг в отличие от механических скрабов, он не удаляет мертвые клетки кожи с частицами. Это косметическое средство больше похоже на крем, чем на эмульсию, содержащую абразив. Поэтому многие люди предполагают, что энзимный пилинг не для них. Между тем его преимуществами обладают не только владельцы сухой, чувствительной
Сегодня, когда у стоматологии появились крылья, много раз можно спасти больной зуб, но безопасно ли это?
Сегодня, когда у стоматологии появились крылья, много раз можно спасти больной зуб, но безопасно ли это? Доктор Уэстон Прайс был одним из первых исследователей, которые поняли связь между лечением корневых каналов и болезнями - и даже смертельно опасными ... Угрожающие микробы Суть лечения корневых каналов заключается в том, чтобы очистить зараженный корневой канал, продезинфицировать его, а затем тщательно заполнить. Желая спасти больной
Интересно, нужна ли вакцинация кошек и стоит ли делать прививку кошке?
Интересно, нужна ли вакцинация кошек и стоит ли делать прививку кошке? Стоит сделать прививку не только кошкам, гуляющим на улице, но и только домашним кошкам. Мы можем случайно привезти в дом некоторые болезни на одежде или обуви. Поэтому лучше предупредить, чем вылечить , особенно когда некоторые заболевания могут оказаться фатальными для нашего питомца. Бесплатная рассылка - последние статьи в вашем почтовом ящике. Если ваша кошка остается
Можем ли мы проверить, нет ли следа вещества, распределяемого в растворе?
Можем ли мы проверить, нет ли следа вещества, распределяемого в растворе? Мы можем это определить - об этом говорит так называемый Авогадро номер. Это число равно 6 x 1023 и описывает количество молекул вещества на моль. Проще говоря, если мы разбавляем что-то большее, чем единица 6 x 1023, то в химии мы рассматриваем это как чистую воду, а не как раствор.
Хорошо ли они питались, были ли сперматозоиды и яйцеклетки идеальным балансом для здоровья в результате хорошего питания их родителей?
Хорошо ли они питались, были ли сперматозоиды и яйцеклетки идеальным балансом для здоровья в результате хорошего питания их родителей? Я сейчас не говорю о генах, потому что, конечно, это играет роль, но гораздо меньше, чем считается, может быть, даже менее 1%, но о состоянии здоровья родителей на момент зачатия. Мать-природа предлагает много способов
3. Поддерживал ли спасенный кровообращение?
3. Поддерживал ли спасенный кровообращение? Проверяется наличие пульса на крупных артериях - шейных, бедренных, плечевых (у детей): ДА очистите дыхательные пути и начните вентиляцию легких. НЕТ после укладки на твердую поверхность спасатель выполняет три основных процедуры реанимации в соответствии со схемой работы. ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ПРИ ОСНОВНЫХ РЕСПИРАТОРНЫХ ЛЕЧЕНИЯХ ДЛЯ ВЗРОСЛЫХ Информация предоставлена ​​с сайта
Есть ли в этих случаях пятна крови и больше сломанных клочков, плавающих в белке?
Есть ли в этих случаях пятна крови и больше сломанных клочков, плавающих в белке? Пятна называются петехиями и вызваны капиллярными сосудами в фолликуле граффии. Другими причинами появления пятен являются генетические состояния, возраст курицы, стресс, микотоксины в корме, дефицит витаминов или болезни. В свою очередь, мясные пятна в белке представляют собой отслоившиеся кусочки маточного эпителия. Можно ли есть такие яйца? В земле татара, чернина, черный пудинг

Как это прочитать?
Вы не знаете, что происходит?
И что на них писать?
Что они?
Почему эти признаки?
Псевдо или вторичная ахалазия: могут ли различаться манометрические данные?
Псевдо или вторичная ахалазия: могут ли различаться манометрические данные?
Существуют ли конкретные критерии, позволяющие отличить ахалазию от основного злокачественного образования?
Каковы типы рубцов, когда их использовать и каковы последствия?
Вопрос только в том, эффективны ли они и способны ли они справиться с растяжками?
Поиск
Меню

Новости
Цистит у женщин, причины, симптомы, как проявляется
Цистит у женщин — одно из самых распространенных и самых неприятных заболеваний, которое может сказаться не только на работоспособности и качестве жизни, но и интимных отношениях. Заболевание это мочевыделительной

Цистит. Женщины, внимание!
Казалось бы, цистит – явление распространенное, ни возрастом, ни полом не ограниченное, встречается этот недуг достаточно часто. Однако женщинам, заболевшим циститом, следует быть особенно внимательными,

Первая помощь при цистите у женщин в домашних условиях: рекомендации
Развитию воспалительного процесса в мочевом пузыре всегда сопутствуют неприятные симптомы, на которые сложно не обращать внимания. Постоянное желание сходить в туалет, режущие, жгучие боли в промежности

Лечение цистита народными средствами у женщин
Воспалительный процесс мочевого пузыря может начаться в любом возрасте. С циститом хотя бы раз сталкивалась каждая женщина. Это заболевание очень коварное: если в первый раз болезнь тщательно не вылечить,

Амоксиклав при воспалении почек: показания и форма выпуска
Для лечения различных почечных заболеваний воспалительного характера, которые вызваны патогенными микроорганизмами, используются антибактериальные препараты. Но к некоторым антибиотикам за многие годы

5-НОК инструкция по применению, состав, показания, аналоги и отзывы
Ознакомьтесь с официальной инструкцией по применению препарата 5-НОК в сокращенной версии. В нее включены: состав, действие, противопоказания и показания к применению, аналоги и отзывы. Текст предоставлен

Признаки и лечение цистита у женщин
Хотя бы один раз в жизни каждая женщина встречалась с циститом, а многие страдают от него постоянно. Цистит трудно лечить, еще сложнее вылечить окончательно, но легко диагностировать. Болезнь не «прячется»,

Лечение цистита у женщин азитромицин
Так, которая выделяется в средине процесса мочеиспускания. Почечная регуляция выведения калия из организма зависит от кислотно-щелочного баланса. Диагностическая гистероскопия (с биопсией эндометрия незадолго

Первая помощь при цистите у женщин
Проявления бывают от небольшого жжения во время мочеиспускания до нестерпимых болей внизу живота. В случае выраженной симптоматики, пациенту требуется быстрая помощь при цистите. Обезболивающие препараты,

Таблетки 5-НОК: инструкция по применению, цена, отзывы при цистите. Показания к применению и аналоги на Medside.ru
Состав Одна таблетка препарата 5-НОК включает 50 мг нитроксолина. Дополнительные вещества: моногидрат лактозы, гидрофосфат кальция, кукурузный крахмал, диоксид кремния коллоидный, тальк, повидон


Реклама

Архив новостей

Реклама