Границы | Экологическая стабильность и инфекционность вируса гепатита С (ВГС) в различных жидкостях организма человека | микробиология

1. Вступление Хроническая инфекция ВГС поражает более 71 миллиона человек во всем мире и может привести...
2. Плазмиды и транскрипция in vitro
3. Электропорация вирусной РНК и получение HCV на основе клеточных культур
4. Иммуногистохимическое окрашивание и титрование вируса
5. Тестирование стабильности ВГС в различных жидкостях организма
6. Вируцидная активность растворов контактных линз
7. Статистика
8. Этические аспекты
9. Результаты
10. Сперма не повышает и не устраняет инфекцию ВГС
11. Спинномозговая жидкость не имеет про- или противовирусного действия на ВГС
12. Слезы не уменьшают инфицирование ВГС, но могут устранить противовирусное действие раствора для контактных...
13. обсуждение
14. Вклад автора
15. финансирование
16. Заявление о конфликте интересов
17. Подтверждения
18. Сокращения

Вступление

Хроническая инфекция ВГС поражает более 71 миллиона человек во всем мире и может привести к заболеваниям печени, таким как хронический гепатит, цирроз и гепатоцеллюлярная карцинома ( Маннс и др., 2017 ). Одним из отличительных признаков HCV является высокая степень изменчивости последовательности, которая, вероятно, способствует его способности устанавливать хронические инфекции. Различные изоляты пациентов сгруппированы в семь генотипов и более 100 подтипов в пределах рода Hepaciviridae семейства Flaviviridae ( Смит и др., 2014 ). Хотя в последние годы на рынок поступило несколько мощных ПППД, вакцины против ВГС до сих пор нет ( Тарр и др., 2015 ). Поэтому работники здравоохранения и другие лица, такие как ПИН или пациенты, находящиеся на диализе, подвергаются постоянному риску заражения ВГС в результате перекрестной передачи и случайного или профессионального воздействия. Хотя точно установлено, что прямой контакт крови с инфицированными людьми может вызывать острую инфекцию ВГС, другие пути передачи не определены, и у одной трети пациентов, инфицированных ВГС, причина инфекции остается неясной ( Понд, 2011 ).

Несколько механических, химических и / или биологических барьеров защищают человека от вирусной или бактериальной инфекции. Например, промывочное действие слез и мочи механически удаляет патогенные микроорганизмы, в то время как ферменты, такие как лизоцим и фосфолипаза А2, в слюне, слезах и грудном молоке могут проявлять антимикробные свойства ( Stiehm and Keller, 2001 ; Маламуд и др., 2011 ; Макдермотт, 2013 ). В нескольких исследованиях сообщалось, что РНК ВГС можно обнаружить в различных жидкостях организма человека, инфицированных ВГС, таких как слюна, сперма, моча, пот и слезы ( Numata и др., 1993 ; Мендель и др., 1997 ; Леруес-Виль и др., 2000 ; Bourlet et al., 2002 ; Ортис-Мовилла и др., 2002 ; Сузуки и др., 2005 ; Ван и др., 2006 ). Тем не менее, было продемонстрировано, что только сыворотка является инфекционной у людей или на экспериментальных животных моделях ( Billerbeck et al., 2013 ; Пфаендер и др., 2016 ) и риск заражения, связанный с различными жидкостями организма человека, недостаточно четко определен. Причиной такой двусмысленности в отношении рисков передачи является то, что эксперименты с инфекцией с первичным материалом HCV технически невозможны, и анализы на клеточных культурах, допускающие инфекцию HCV, не были доступны в течение длительного времени Штайнманн и Питшманн, 2013 ). Это препятствие было преодолено благодаря разработке системы культивирования клеток HCV на основе изолята JFH HCV ( Вакита и др., 2005 ) и фактически различные исследования недавно оценили стабильность ВГС и его восприимчивость к различным биоцидам с использованием этой системы ( Ciesek et al., 2010 ; Doerrbecker и др., 2011 , 2013 ). Кроме того, недавно мы могли показать, что грудное молоко человека оказывает противовирусный эффект против HCV из-за эндогенной липазозависимой генерации свободных жирных кислот, которая разрушает оболочку вирусного липида HCV ( Пфаендер и др., 2013 ). Тем не менее, анти- или провирусные эффекты других жидкостей организма человека до сих пор не исследованы.

В этом исследовании мы исследовали стабильность HCV в окружающей среде в слюне, сперме, CSF и слезах, позднее в сочетании с растворами для контактных линз, чтобы выяснить потенциальные риски передачи или свойства инактивации этих жидкостей человеческого организма.

Материалы и методы

Клеточная культура и реагенты

Для экспериментов с инфекцией HCV использовали клеточную линию гепатомы человека, обозначенную Huh7.5, которая является разрешающей для инфекции и репликации HCV ( Штейнман и др., 2008 ). Клетки выращивали в модифицированной по Дульбекко среде Игла (DMEM; Invitrogen, Карлсруэ, Германия) с добавлением 2 мМ L-глутамина, незаменимых аминокислот, 100 ед. Пенициллина на мл, 100 мкг стрептомицина на мл и 10% плодов. сыворотка теленка (полный DMEM).

Плазмиды и транскрипция in vitro

Плазмида pFK-Jc1 была описана недавно и кодирует внутригенотипический 2a / 2a химерный вирус Jc1 ( Питчман и др., 2006 ). In vitro транскрипты отдельных конструкций были получены путем линеаризации 5-10 мкг плазмиды Jc1 путем расщепления в течение 1 часа Mlu I. Плазмидную ДНК экстрагировали фенолом и хлороформом и после осаждения этанолом растворяли в воде, не содержащей РНКазы. Реакционные смеси для транскрипции in vitro содержали 80 мМ HEPES (рН 7,5), 12 мМ MgCl2, 2 мМ спермидина, 40 мМ дитиотреитола (DTT), концентрацию 3,125 мМ каждого рибонуклеозидтрифосфата, 1 ед. РНазина (Promega, Mannheim, Германия) на 1 мкл, 0,1 мкг плазмидной ДНК / мкл и 0,6 ед. РНК-полимеразы Т7 (Promega) на мкл. После инкубации в течение 2 часов при 37 ° С добавляли еще 0,3 ед. Реакционной смеси Р7-полимеразы Т7 / мкл, а затем еще 2 часа при 37 ° С. Транскрипция была прекращена путем добавления 1,2 ед. РНКаз-свободной ДНКазы (Promega) на мкг плазмидной ДНК и 30-минутной инкубации при 37 ° С. РНК экстрагировали кислым фенолом и хлороформом, осаждали изопропанолом и растворяли в воде без РНКазы. Концентрацию определяли путем измерения оптической плотности при 260 нм. Денатурирующий электрофорез в агарозном геле использовали для проверки целостности РНК.

Электропорация вирусной РНК и получение HCV на основе клеточных культур

Для электропорации РНК HCV в клетки Huh7.5 готовили суспензии отдельных клеток путем трипсинизации монослоев и последующей ресуспендии с завершением DMEM. Клетки Huh7,5 промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), подсчитывали и ресуспендировали при 1,5 × 107 клеток на мл в цитомиксе, содержащем 2 мМ АТФ и 5 мМ глутатиона. Если не указано иное, 10 мкг транскрибированной РНК in vitro смешивали с 400 мкл клеточной суспензии путем пипетирования и затем электропорировали с помощью системы Gene Pulser (Bio-Rad, Munich, Germany) в кювете с шириной зазора 0,4 см (Bio- Rad) при 975 мкФ и 270 В. Клетки были немедленно перенесены в 16 мл полного DMEM, и 8 мл клеточной суспензии высевали на лунку. Вирусосодержащие культуральные жидкости собирали через 48, 72 и 96 ч и концентрировали с использованием центриконов (Centricon plus-70, Millipore, United States). Для определения вирусной инфекционности использовали бесклеточные супернатанты для заражения наивных клеток-мишеней Huh7,5.

Иммуногистохимическое окрашивание и титрование вируса

Титры вируса определяли, как описано в другом месте ( Ciesek et al., 2011 ). Вкратце, клетки Huh7,5 высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 1 × 104 клеток на лунку за 24 ч до инокуляции разведениями отфильтрованного супернатанта клеточной культуры (по меньшей мере шесть лунок использовали для разведения). Через два-три дня клетки промывали PBS, фиксировали в течение 20 минут ледяным метанолом при -20 ° C, трижды промывали PBS, а затем проникали и блокировали в течение 1 часа PBS, содержащим 0,5% сапонина, 1% крупного рогатого скота сывороточный альбумин, 0,2% сухого обезжиренного молока и 0,02% натриевой кислоты. Эндогенные пероксидазы блокировали путем инкубации клеток в течение 5 минут с PBS, содержащим 0,3% перекиси водорода. После трехкратного промывания PBS и один раз PBS, содержащим 0,5% сапонина (PBS - сапонин), NS5A детектировали с разведением 1: 1000 супернатанта гибридомы 9E10 в PBS - сапонине в течение 1 часа при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° C. Клетки промывали, как описано выше, и связанное антитело 9E10 детектировали путем инкубации с пероксидазо-конъюгированными антителами, специфичными к мышиному IgG (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany), разведенными 1: 200 в PBS - сапонине. После 1 ч инкубации при комнатной температуре клетки промывали, как указано выше. Наконец, активность пероксидазы определяли с использованием набора субстратов Vector NovaRED (Linaris, Wertheim, Germany) и определяли TCID50.

Тестирование стабильности ВГС в различных жидкостях организма

Чтобы проверить, изменяется ли стабильность HCV в различных жидкостях организма, вирус, разведенный в слезах (1: 8), CSF (1: 9), сперме (1: 9) или слюне (1: 9), инкубировали при комнатной температуре для соответствующего временной период. Влияние жидкости организма на стабильность HCV сравнивали с вирусной суспензией, содержащей соответствующее количество PBS. После инкубационного периода клетки-мишени инфицировали в анализе с ограниченным разведением на клетках Huh7,5. TCID50 определяли через 72 ч после заражения, как описано ранее ( Штейнман и др., 2008 ).

Вируцидная активность растворов контактных линз

Тестирование вирулицидной активности восьми различных растворов контактных линз (таблица 1 ) проводили путем смешивания двух частей тестовой вирусной суспензии с восемью частями соответствующих растворов контактных линз по аналогии с тестом вирусной суспензии, описанным ранее ( Ciesek et al., 2010 ). После различного времени инкубации тестируемые смеси немедленно серийно разводили в DMEM и определяли титры вируса с помощью TCID50. Для анализа влияния слезных жидкостей на вирулицидную активность растворов контактных линз одну часть суспензии тестируемого вируса, одну часть слезной жидкости и восемь частей растворов контактных линз смешивали и тестировали, как описано выше.

Таблица 1. Растворы для контактных линз, использованные в данном исследовании, и их активные ингредиенты

Статистика

Для статистического анализа либо односторонний ANOVA с последующим тестом множественных сравнений Даннетта, либо двусторонний ANOVA с последующим тестом множественных сравнений Sidak проводили с использованием GraphPad Prism версии 7.03 для Windows, GraphPad Software, La Jolla, CA, United States, www.graphpad.com ,

Этические аспекты

Все жидкости организма были получены от здоровых добровольцев с отрицательной РНК ВГС и ВГС. Образцы CSF были использованы после выполнения обычной микробиологической диагностики. Исследование не включало детали пациента и не приводило к дополнительным ограничениям для пациентов. Все данные были анонимно проанализированы. Исследование было одобрено комитетом по этике Ганноверской медицинской школы, Германия.

Результаты

Инфекционный ВГС может сохраняться в слюне в течение длительного времени

Слюна хорошо описана благодаря своим антимикробным эффектам из-за различных ферментов ( Маламуд и др., 2011 ). Тем не менее, некоторые человеческие вирусы могут эффективно передаваться слюной путем прямой передачи от инфицированных лиц к неинфицированным людям ( Росс, 1971 ). РНК ВГС была обнаружена в слюне инфицированных пациентов ( Сузуки и др., 2005 ; Ван и др., 2006 ), однако, его инфекционный потенциал до сих пор не проанализирован. Чтобы оценить стабильность HCV в слюне и влияние потенциальных защитных механизмов, присутствующих в этой жидкости организма, HCV и слюну инкубировали в суспензии в течение выбранных моментов времени до 28 дней при комнатной температуре. В качестве контроля вирус инкубировали с PBS. Для учета донорских вариаций использовались образцы слюны от пяти отдельных доноров. Инфекцию определяли путем анализа с ограниченным разведением. Инфекция HCV обнаруживалась до 21 дня при комнатной температуре во всех образцах с незначительным различием между слюной и контрольными инкубированными образцами (рисунок 1 ). Для одного донора можно было наблюдать даже более высокие вирусные титры по сравнению с контрольной инкубацией. Общая инфекционность снижалась в зависимости от времени, однако противовирусного эффекта слюны на инфекционность ВГС не наблюдалось. Через четыре недели после инокуляции инфекционность ВГС упала ниже предела обнаружения только в двух из пяти донорских проб (рисунок 1 ). В заключение, HCV стабилен в слюне до 3 недель при комнатной температуре и сохраняет свой инфекционный потенциал.

РИСУНОК 1. Стабильность ВГС в слюне человека. Одна часть вируса была добавлена ​​к одной части слюны и инкубирована в течение 7, 14, 21 или 28 дней при комнатной температуре. Были использованы образцы слюны пяти отдельных доноров (черные кружки). Слюну фильтровали (0,45 мкм) и хранили при 4 ° С перед тестированием. В необработанном контроле слюна была заменена PBS (незакрашенные кружки). После инкубации смеси хранили при -80 ° C до определения вирусных титров с помощью анализа с предельным разведением для расчета дозы инфекции тканевой культуры (TCID50 / мл). Данные были нормализованы к инфекции в нулевой момент времени каждого эксперимента. Пунктирная линия показывает фон анализа, нс, несущественно.

Сперма не повышает и не устраняет инфекцию ВГС

Вирус гепатита С может передаваться половым путем. Terrault et al. (2013) Установлено, что максимальная частота передачи ВГС по полу составляет 0,07% в год, что ниже по сравнению с другими заболеваниями, передаваемыми половым путем, такими как ВИЧ или вирус простого герпеса типа 2 (ВПГ-2). Специально для ВИЧ было описано, что сперма повышает инфекционность ВИЧ ( Münch et al., 2007 ), тем самым облегчая передачу вируса. Затем мы исследовали влияние спермы на инфекционность ВГС. Для этого мы собрали сперму у здоровых добровольцев и инкубировали ее вместе с HCV в суспензии в течение 24 ч при комнатной температуре. Инфекцию определяли путем анализа с ограниченным разведением через 72 часа. В общей сложности был использован пул из 30 различных образцов спермы, включая образцы спермы от 10 отдельных доноров. Как показано на рисунке 2 ни один из протестированных образцов спермы не увеличивал и не отменял инфекционность ВГС в этих экспериментальных условиях (рисунок 2 ). Эти результаты показывают, что потенциальный инфекционный вирус, присутствующий в сперме, остается стабильным, и, по-видимому, семенная жидкость не влияет на инфекционность.

РИСУНОК 2. Стабильность ВГС в сперме человека. Одна часть вируса была добавлена ​​к девяти частям спермы и инкубирована в течение 24 ч при комнатной температуре. Использовали пул из 30 различных образцов спермы и образцов спермы от девяти отдельных доноров (черные кружки). В необработанном контроле сперма была заменена PBS (незакрашенные кружки). Титры вируса определяли с помощью анализа с ограниченным разведением, чтобы рассчитать дозу инфекции тканевой культуры (TCID 50 / мл), нс, несущественно.

Спинномозговая жидкость не имеет про- или противовирусного действия на ВГС

Несмотря на то, что ВГС проявляет тропизм печени, были описаны внепеченочные проявления ( Негр и др., 2015 ). До сих пор долго спорят, инфицирует ли ВГС мозг, однако до 20–80% пациентов с хроническим ВГС проявляют такие симптомы, как хроническая усталость ( Ярлотт и др., 2017 ). Кроме того, есть несколько сообщений о дефиците внимания, концентрации и памяти или депрессии ( Ярлотт и др., 2017 ). Кроме того, РНК HCV была обнаружена в CSF и мозге хронически инфицированных пациентов с невропатологическими нарушениями ( Maggi et al., 1999 ; Ласкус и др., 2002 ; Варгас и др., 2002 ). Флетчер и соавт. (2012) показали, что микрососудистые эндотелиальные клетки мозга (BMECs) являются пермиссивными для инфекции HCV в культуре, однако неизвестно, может ли сам CSF иметь про- или противовирусные эффекты. Чтобы ответить на этот вопрос, мы проверили инфекционность ВГС в СМЖ восьми разных людей путем инкубации в выбранные моменты времени при комнатной температуре. В качестве контроля вирус инкубировали с PBS в суспензии. Мы отслеживали вирусную стабильность при CSF в течение 21 дня и не смогли обнаружить какие-либо про- или противовирусные эффекты на ВГС (рис. 3 ). Вирус оставался заразным с течением времени. Это указывает на то, что вирус, который потенциально проникает через гематоэнцефалический барьер и попадает в ЦСЖ, сохраняет свою инфекционную способность в течение нескольких недель.

РИСУНОК 3. Влияние СМЖ на ВГС. Одна часть вируса была добавлена ​​в девять частей CSF и инкубирована в течение 7, 14, 21 или 28 дней при комнатной температуре. Использовали образцы CSF от восьми отдельных доноров (черные кружки). В необработанном контроле раствор заменяется PBS (незакрашенные кружки). Образцы хранили при -80 ° C до определения вирусных титров с помощью анализа с предельным разведением для расчета дозы инфекции тканевой культуры (TCID50 / мл). Данные были нормализованы к инфекции в нулевой момент времени каждого эксперимента. Пунктирная линия показывает фон анализа, нс, несущественно.

Слезы не уменьшают инфицирование ВГС, но могут устранить противовирусное действие раствора для контактных линз

Было показано, что слезная жидкость от хронически инфицированных ВГС пациентов содержит копии вирусного генома, как было определено с помощью КРТ-ПЦР ( Feucht et al., 1994 ; Мендель и др., 1997 ; Комацу и др., 2012 ). Однако нет никаких признаков того, что ВГС может передаваться через слезы. Известно, что слезная жидкость содержит несколько противовирусных и противомикробных компонентов ( Чендлер и Джилетт, 1983 ). Чтобы выяснить, может ли слезная жидкость потенциально инактивировать ВГС, слезную жидкость здорового добровольца и вирусную суспензию инкубировали в течение выбранных моментов времени при комнатной температуре. Как показано на рисунке 4A Мы не смогли обнаружить какого-либо влияния на инфекционность ВГС через 5 минут и 20 часов после инкубации со слезами, что свидетельствует о том, что потенциальные антимикробные факторы, присутствующие в слезной жидкости, не способны в достаточной степени инактивировать ВГС (рис. 4A ).

РИСУНОК 4. Влияние слезной жидкости и растворов для очистки контактных линз на ВГС. (A) Восемь частей среды инкубировали с одной частью слезной жидкости и с частью суспензии вируса в течение 5 минут (черные столбцы) или 20 часов (серые столбцы) при комнатной температуре. Для необработанного контроля использовали PBS. Титры вируса определяли с помощью анализа с предельным разведением, чтобы рассчитать дозу инфекции тканевой культуры (TCID50 / мл). (B) Одна часть вируса была добавлена ​​к девяти частям выбранного раствора для очистки контактных линз и инкубирована в течение 5 минут (черные столбцы) или 20 часов (серые столбцы) при комнатной температуре. Для необработанного контроля использовали PBS. Титры вируса определяли с помощью анализа с предельным разведением, чтобы рассчитать дозу инфекции тканевой культуры (TCID50 / мл). nd, не обнаружено выше уровня токсичности, ∗∗∗ p ≤ 0,001. (C) Восемь частей раствора для контактных линз Oculsoft comfort инкубировали с одной частью слезной жидкости и с частью суспензии вируса в течение 5 минут (черные столбцы) или 20 часов (серые столбцы). Для необработанного контроля использовали PBS. Слезная жидкость была заменена в контроле PBS. Титры вируса определяли с помощью анализа с предельным разведением, чтобы рассчитать дозу инфекции тканевой культуры (TCID50 / мл).

Учитывая хорошо документированное присутствие РНК HCV в слезах, мы затем хотели оценить влияние растворов контактных линз на стабильность вируса. С этой целью мы выбрали восемь различных коммерчески доступных решений для контактных линз для очистки и хранения контактных линз (таблица 1 ). Растворы для контактных линз были основаны на различных ингредиентах, таких как перекись водорода, поликватерниум, миристамидопропилдиметиламин и полигексанид. Для анализа вирусной стабильности одну часть ВГС добавляли к девяти частям выбранного раствора для очистки контактных линз и инкубировали в течение обозначенных временных точек при комнатной температуре. Только один раствор (AOSept® Plus; «AO sept»), основанный на перекиси водорода, был способен достаточно быстро и полностью инактивировать инфекционность HCV, тогда как другие растворы демонстрировали низкую противовирусную активность или были способны снижать вирусные титры только после длительного пролонгирования время инкубации 20 ч (рисунок 4В ). Мы выбрали один раствор для контактных линз, а именно «Oculsoft comfort», который был способен эффективно снижать вирусные титры после длительного инкубационного периода в 20 часов, чтобы имитировать более физиологическую ситуацию и исследовать, влиял ли противовирусный эффект из-за наличия слезной жидкости. Поэтому мы инкубировали в течение 5 минут и 20 часов раствор «Oculsoft comfort» со слезной жидкостью и вирусной суспензией и определяли вирусные титры с помощью анализа с ограниченным разведением. Интересно, что в присутствии слезной жидкости ингибирующий эффект на инфекционность HCV раствора для контактных линз был отменен (рисунок 4C ). В заключение мы можем показать, что инфекционность ВГС остается стабильной в слезной жидкости и что коммерчески доступных растворов для контактных линз редко бывает достаточно для инактивации потенциально загрязненной линзы.

обсуждение

Известно, что некоторые вирусы передаются через слюну, классическим примером является мононуклеоз, вызванный вирусом Эпштейна-Барра, который широко известен как болезнь поцелуев ( Нидерман и др., 1970 ). Существует несколько исследований, в которых описывается наличие РНК HCV в слюне у 39–72% хронически инфицированных пациентов ( Феррейро и др., 2005 ). Однако большинство эпидемиологических исследований показывают, что передача ВГС через загрязненную слюну является низкой, и нет никаких доказательств того, что ВГС может легко распространяться через обмен слюны, например, при поцелуях, чихании, кашле и т. Д. ( Феррейро и др., 2005 ). По-видимому, существует корреляция между наличием вируса в слюне и вирусной нагрузкой в ​​крови, однако уровни вируса в слюне в целом низкие по сравнению с уровнями в крови ( Ван и др., 1992 ; Numata и др., 1993 ). Не известно, существуют ли специфические защитные механизмы, например, из-за присутствия нейтрализующих антител или неспецифических защитных механизмов, таких как противовирусные ферменты, которые способствуют этому наблюдаемому низкому пути передачи. Чтобы проанализировать потенциальные противовирусные механизмы в слюне здоровых людей, мы проверили стабильность ВГС в течение длительного времени. Инфекция HCV неожиданно не изменялась при инкубации со слюной и оставалась стабильной до 1 месяца. Возможно, что наблюдаемый низкий уровень вируса, присутствующего в слюне, недостаточен для обеспечения эффективной передачи; однако, потенциальным риском не следует пренебрегать, особенно в тех случаях, когда естественный барьер нарушен.

В то время как ВИЧ в основном передается половым путем, риск передачи вируса гепатита С по этому маршруту представляется довольно низким и связан с конкретными группами риска, такими как МСМ ( Батлер и др., 2010 ). Хотя было показано, что полученные из спермы фибриллы усиливают инфекционность ВИЧ ( Münch et al., 2007 ), влияние семенной жидкости на стабильность ВГС неясно. Поэтому мы стремились проанализировать вирусную инфекционность в сперме от здоровых доноров. В отличие от ВИЧ, мы могли бы продемонстрировать, что на инфекционность ВГС не влияла сперма, поскольку она не отменяла и не увеличивала вирусную инфекционность, предполагая, что семенной амилоид также не влияет на инфекционность ВГС.

Несколько пациентов с ВГС испытывают значительные изменения в своем физическом и психическом благополучии, которые чаще всего проявляются в виде усталости и депрессии. В самом деле, мозг был предложен как внепеченочный сайт репликации для HCV с эндотелиальными клетками из гематоэнцефалического барьера и клетками периферической нейробластомы, способными поддерживать инфекцию HCV ( Бургель и др., 2011 ; Флетчер и др., 2012 ). Laskus et al. (2002) смогли показать, что около 60% всех пациентов с хроническим ВГС имели определяемые уровни РНК ВГС в ЦСЖ. Недавнее исследование даже выявило генетическую компартментализацию в CSF у пациентов с нарушениями умственного развития, поддерживая теорию внепеченочных проявлений ( Талли и др., 2016 ). CSF содержит> 99% воды, небольшое количество белков плазмы и глюкозы и спорадических лимфоцитов ( Спектор и др., 2015 ). Антимикробные свойства не описаны, но низкое количество белков и глюкозы может привести к снижению стабильности вирусов в СМЖ. Мы здесь показываем, что HCV, инкубированный в CSF, так же стабилен, как HCV, инкубированный в PBS. Мы могли бы подтвердить, что CSF не обладает противовирусной активностью против HCV и что HCV может выживать в CSF в течение более длительного периода времени.

Наряду с другими жидкостями организма, РНК ВГС легко обнаруживается в слезной жидкости пациентов, инфицированных ВГС ( Фейхт и др., 1994 ; Мендель и др., 1997 ). Также для других вирусов, таких как ВИЧ, HBV или вирус Эбола, слезы были описаны как вирусная положительная жидкость организма ( Су и др., 1994 ; Хан и др., 2011 ; Веттер и др., 2016 ). Важно отметить, что вирус гепатита В, выделенный из слез хронически инфицированных пациентов, на животной модели был даже заразным ( Комацу и др., 2012 ), подчеркивая возможный риск вирусной передачи через слезную жидкость. Тем не менее, опосредованная слезами передача HCV до сих пор не описана. Известно, что слезы содержат ряд противомикробных компонентов, которые помогают защитить глаза от инфекции ( Фланаган и Уиллкокс, 2009 ). Одним из важных компонентов является лактоферрин, который был описан благодаря своим антимикробным и противовоспалительным свойствам ( Фланаган и Уиллкокс, 2009 ). Чтобы выяснить, способен ли ВГС сохранять свою инфекционность в слезной жидкости, мы проанализировали его стабильность при искусственном загрязнении ВГС и не наблюдали снижения титра вируса. Это указывает на то, что описанные возможные противовирусные компоненты, присутствующие в слезной жидкости, такие как лактоферрин, недостаточны для инактивации ВГС. Затем мы дополнительно проверили, были ли имеющиеся в продаже растворы для контактных линз способными неактивировать потенциальное загрязнение ВГС. Удивительно, что растворы, которые не основаны на перекиси водорода, не могли легко инактивировать ВГС. Только два других раствора смогли снизить вирусные титры на несколько порядков после 20 ч инкубации. Еще более важно, что противовирусный эффект раствора с одной контактной линзой отменяется в присутствии слезной жидкости. Явление, которое также наблюдается для различных бактерий ( Хильдебрандт и др., 2012 ). Эти результаты впервые показывают, что некоторые жидкости организма не оказывают противовирусного действия против ВГС. Однако, чтобы определить, могут ли они быть возможным источником передачи ВГС в окружающей среде, необходимы эксперименты in vivo , например, с гуманизированными мышами. РНК HCV была также обнаружена в поте человека у HCV-позитивных пациентов ( Ортис-Мовилла и др., 2002 ) а также моча ( Numata и др., 1993 ), однако, обе жидкости организма не были включены в настоящее исследование для дальнейшего анализа.

Таким образом, мы представляем первое систематическое исследование стабильности и инфекционности ВГС в различных жидкостях организма. Несмотря на то, что передача через слюну, слезы, сперму или другие жидкости, не относящиеся к родителям, считается редкой, мы можем четко продемонстрировать, что вирус остается инфекционным в этих жидкостях и потенциально может стать переданным. Вполне вероятно, что снижение вирусных нагрузок в различных жидкостях организма по сравнению с вирусными уровнями в крови является причиной наблюдаемой низкой скорости передачи, однако передача все же возможна, и ее риском не следует полностью пренебрегать. В заключение, строгое соблюдение установленных гигиенических норм должно быть обязательным, чтобы избежать дальнейших инфекций ВГС.

Вклад автора

SP и FH провели эксперименты, проанализировали данные и написали первый черновик рукописи. AS, JH, NR и WW провели эксперименты. DT проанализировал данные. PB, JS, JM и SC внесли научный вклад. Э.С. разработал исследование и написал рукопись.

финансирование

ЭС была поддержана Центром исследований инфекций им. Гельмгольца. JM был поддержан через CRC1279.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Рецензент SG объявил о прошлом соавторстве с одним из авторов ES редактору обработки.

Рецензент ДП и редактор редакции заявили о своей общей принадлежности.

Подтверждения

Мы благодарны Takaji Wakita и Jens Bukh за изоляты JFH1 и J6CF соответственно и Чарльзу Райсу за клетки Huh-7.5 и моноклональное антитело E9E10. Кроме того, мы благодарим всех членов Института экспериментальной вирусологии TWINCORE за полезную поддержку, предложения и обсуждения.

Сокращения

CSF, спинномозговая жидкость; DAA, противовирусные препараты прямого действия; HBV, вирус гепатита В; HCV, вирус гепатита С; ВИЧ, вирус иммунодефицита человека; JFH, молниеносный японский гепатит; МСМ, мужчины, имеющие половые контакты с мужчинами; ПИН, люди, употребляющие инъекционные наркотики; qRT-PCR, количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени; SD, стандартное отклонение; TCID50, инфекционная доза для культуры ткани 50.

Рекомендации

Похожие

Комментарии